Giới thiệu kỹ thuật PCR

Thuật ngữ PCR là viết tắt của " Polymerase-Chain-Reaction ", đây là một phản ứng nhân văn DNA dựa trên những chu kỳ luân hồi nhiệt. Bài viết này nhằm mục đích ra mắt những thông tin quan yếu về kỹ thuật PCR cũng như những yếu tố thường gặp lúc sử dụng kỹ thuật này .

KỸ THUẬT PCR LÀ GÌ?

Bạn đang đọc: Giới thiệu kỹ thuật PCR

Thuật ngữ PCR chỉ một phản ứng nhân văn DNA dựa trên những chu kỳ luân hồi nhiệt. Phản ứng diễn ra trong một ống thử nhỏ chứa dung dịch phản ứng ( gọi là PCR mix ). Trong PCR mix sẽ chứa những thành phần :

  • 1) Polymerase chịu nhiệt (Taq polymerase), enzyme này mang nhiệt độ hoạt động tối ưu ở 72 oC.

  • 2) 4 loại nucleotide (dNTP) gồm: dATP/dTTP/dGTP/dCTP là vật liệu để tổng hợp ra những bản sao DNA.

  • 3) DNA chứa trình tự mục tiêu (Template): Thông thường trong xét nghiệm thì đây là DNA thu nhận từ mẫu cần xét nghiệm.

  • 4) Cặp mồi đặc hiệu (Primer): Đây là những đoạn oligo-nucleotide dài khoảng 20 nucleotide và bắt cặp bổ sung đặc hiệu cho 2 đầu trình tự mục tiêu cần nhân văn.

  • 5) Cation Mg2+ (MgCl2): đây là co-factor quan yếu để Taq polymerase hoạt động hiệu quả.

  • 6) Dung dịch đệm Tris-KCl (PCR Buffer): Phân phối môi trường thuận lợi cho phản ứng nhân văn diễn ra.

Ống thử chứa PCR mix sẽ được đặt vào trong buồng ủ của máy luân nhiệt ( Thermo cycler ), ở Nước Ta thì thường gọi luôn là máy PCR. Nhiệt độ bên trong buồng ủ của máy PCR sẽ biến hóa theo chu kỳ luân hồi, nhờ đó mà thứ tự nhân văn DNA được tổ chức ( xem video ) .

NGUYÊN TẮC HOẠT ĐỘNG CỦA PCR

Một chu kỳ luân hồi nhiệt của PCR sẽ gồm 3 thứ tự tiến độ nhiệt độ ( Hình 1 ) :

  • 1 – Giai đoạn biến tính: Nhiệt độ sẽ được đưa lên 94 oC, những liên kết hydro sẽ bị phá vỡ khiến cho DNA bị biến tính trở thành dạng mạch đơn.

  • 2 – Giai đoạn bắt cặp: Nhiệt độ được hạ xuống 55 – 65 oC, những đoạn mồi sẽ bắt cặp bổ sung vào 2 đầu trình tự mục tiêu.

  • 3 – Giai đoạn kéo dài: Nhiệt độ được đưa lên 72 oC, Taq polymerase sẽ sử dụng dNTP để kéo dài đầu 3' của mồi và tạo ra mạch bổ sung.

Tương tự, cứ qua một chu kỳ luân hồi nhiệt, số mạch DNA sẽ được nhân đôi. Nếu chu kỳ luân hồi nhiệt tái diễn liên tục 30 – 40 lần thì số bản sao sẽ là 230 ~ 240 bản sao. Số lượng bản sao DNA khổng lồ này lúc được gắn những phân tử phát tín hiệu ( ví dụ Ethidium Bromide ) hoàn toàn mang thể nhìn thấy bằng mắt thường trên gel điện di dưới ánh đèn UV ( Hình 2 ) .

VẤN ĐỀ NGOẠI NHIỄM SẢN PHẨM PCR

Nguyên lý của PCR là khuếch đại DNA, thế cho nên những phòng thí nghiệm sử dụng PCR liên tục ko sớm thì muộn cũng sẽ bị nhiễm mẫu sản phẩm PCR lên toàn bộ những thiết bị, dụng cụ, hóa chất. Người làm thí nghiệm sẽ trông thấy được thảm họa này lúc hàng loạt những lần chạy PCR đều ra dương thế, kể cả lúc sử dụng mẫu là nước chứa. Lúc điều này xảy ra thì chỉ mang cách bỏ hàng loạt hóa chất, khử nhiễm hàng loạt phòng thí nghiệm …. Dù vậy điều này vẫn sẽ tái diễn sau một khoảng chừng thời hạn sử dụng PCR .

Nhiễm mẫu sản phẩm PCR từng là thử thách so với những phòng thí nghiệm sinh vật học phân tử. Tuy nhiên, lúc bấy giờ những nhà khoa học đã hoàn toàn mang thể xử lý yếu tố này một cách khá hữu hiệu ( Hình 3 ), đó là trong thành phần dNTP mang bổ trợ thêm một tẹo ít dUTP. Những mẫu sản phẩm PCR tạo ra sẽ luôn sống sót 1 số ít vị trí là U thay vì T, những vị trí U này sẽ hoàn toàn mang thể khắc phục và xử lý phân hủy bằng enzme UNG. Mẫu DNA thu nhận từ mẫu thật ( template ) sẽ ko chứa U, thế cho nên ủ PCR mix với enzyme UNG trước lúc PCR sẽ giúp phân cắt hàng loạt những DNA ngoại nhiễm mà ko tác động tác động tới template .

CÁC KỸ THUẬT PCR THƯỜNG GẶP TRONG XÉT NGHIỆM

1) PCR đơn mồi (Simplex PCR): Đây là kiểu PCR cổ điển nhất, sử dụng 1 cặp mồi đặc hiệu để khuếch đại 1 đoạn trình tự mục tiêu duy nhất.

2) PCR đa mồi (Multiplex PCR): Đây là kiểu PCR sử dụng nhiều cặp mồi khác nhau để khuếch đại những trình tự mục tiêu khác nhau trong cùng 1 mix phản ứng. Để thiết kế được phản ứng Multiplex PCR đòi hỏi những cặp mồi sử dụng phải mang cùng nhiệt độ bắt cặp và những cặp mồi này cũng ko được bắt cặp với nhau hay bắt cặp chéo lẫn nhau. Ngoài ra, cũng phải đảm bảo độ nhạy Multiplex PCR tương đương với Simplex PCR, điều này rất khó xảy ra nên thông thường multiplex PCR được sử dụng ở những tế bào nuôi cấy vì lúc này số lượng trình tự đích đủ to sẽ ko đòi hỏi quá khó tính về độ nhạy.

3) PCR tổ (Nested PCR): Sử dụng 2 cặp mồi, cặp mồi bên ngoài (outer primer) và cặp mồi bên trong (nested primer). Cặp mồi bên ngoài sẽ tham gia PCR lần 1 trước để làm tăng số lượng DNA chứa trình tự đích, kế tới là cặp mồi bên trong sẽ tham gia PCR lần 2 để phát hiện trình tự đích (Hình 4). Kỹ thuật này sử dụng lúc cặp mồi đặc hiệu cho trình tự đích (nested primer) mang độ nhạy kém.

4) RT-PCR: Là thứ tự sử dụng lúc trình tự đích là RNA, lúc này cần một bước sử dụng enzyme reverse transcriptase để chuyển RNA thành cDNA trước lúc PCR, giai đoạn này gọi là giai đoạn RT. Kỹ thuật RT-PCR mang 2 loại (Hình 5):

  • RT-PCR 2 bước: Bước ủ RT thực hiện ở 1 ống thử riêng, cDNA tạo thành sẽ được chuyển vào ống thử chứa PCR mix để thực hiện PCR.

  • RT-PCR 1 bước: Cả 2 bước RT và PCR đều thực hiện trong 1 ống thử duy nhất, mix ban sơ sẽ chứa cả những thành phần cho RT lẫn cho PCR.

TÀI LIỆU THAM KHẢO

Phạm Hùng Vân. PCR và real-time PCR : Những yếu tố cơ bản và những ứng dụng thường gặp .

Source: https://bloghong.com
Category: Là Gì